Donkey Kong is “kongnapped” door de gemene K. Rool en de Kremlings, en het is aan Diddy Kong en zijn vriendin Dixie Kong om hem te redden.
Alle bekende vijanden en behulpzame vrienden keren terug, samen met enkele nieuwe personages, waaronder de wijze Wrinkly Kong die je belangrijke lessen in het spel zal leren. Opnieuw ligt de nadruk op het verzamelen van bananen, terwijl elke honderd bananen een extra leven vormt. Naast het verslaan van K. Rool en het redden van Donkey Kong, zijn er extra missies die voltooid kunnen worden. Verzamel genoeg K. Rool Kremkoins om de routes naar de Verloren Wereld te openen, terwijl elk level een verborgen Hero Coin heeft om te verzamelen.
De Game Boy Advance-versie bevat ook een bonusmodus met drie minigames (Expresso’s Racing, Funky’s Flights en Bag a Bug) plus een time attack-modus genaamd Diddy’s Dash (voltooi levels zo snel mogelijk als Diddy Kong). Deze versie van het spel bevat ook een extra baas (Kerozene) en twee extra verzamelobjecten (Gouden Veren die de statistieken van Express verhogen in het Expresso’s Racing bonusspel en foto’s die een plakboek vullen). Door de toevoeging van bonusspellen en het plakboek werden er ook 28 extra Hero Coins toegevoegd.



