Super Mario Bros. 3 is een singleplayer- en multiplayer side-scrolling platformspel. Het verhaal volgt Mario en Luigi terwijl ze door de Paddenstoelenwereld reizen, nadat Bowser en zijn zeven kinderen, de Koopalings, magische toverstokken stelen van de koningen van elk rijk. De Koopalings gebruiken de toverstokken om de koningen in dieren te veranderen, terwijl prinses Peach opnieuw wordt ontvoerd en gegijzeld. De broers moeten de koningen in hun ware gedaante herstellen, de toverstokken terugwinnen en uiteindelijk Bowser confronteren om de prinses te redden.
De gameplay bouwt voort op de fundamenten van de eerdere Super Mario Bros.-titels, maar breidt deze aanzienlijk uit met grotere levels, meer variatie en nieuwe mechanieken. Spelers bewegen zich door thematische werelden, elk bestaande uit meerdere levels die verbonden zijn door een wereldkaart. Navigatie op de kaart maakt het mogelijk om paden te kiezen, toegang te krijgen tot Toad Houses voor bonusitems, en ontmoetingen met rondzwervende Hammer Bros. of andere vijanden. Levels bevatten de klassieke platformformule van rennen, springen en stampen op vijanden, gecombineerd met obstakels zoals buizen, bewegende platforms en omgevingsgevaren.
Power-ups spelen een centrale rol, waarbij terugkerende items zoals de Super Mushroom en Fire Flower worden gecombineerd met nieuwe toevoegingen die meer diverse vaardigheden introduceren. De Super Leaf verandert Mario in Raccoon Mario, waardoor hij met zijn staart kan aanvallen en kort kan vliegen nadat hij aan snelheid is gekomen. Andere pakken zijn onder meer het Frog Suit voor verbeterd zwemmen, het Tanooki Suit voor vliegen en tijdelijke stenen transformaties, en het Hammer Suit, waarmee werphamers kunnen worden gebruikt vergelijkbaar met die van de Hammer Bros. De Starman keert terug en geeft korte tijd onkwetsbaarheid, terwijl de zeldzame Warp Whistle spelers laat doorspringen naar latere werelden.
Voortgang door het spel vereist het voltooien van standaard platformlevels, fortmini-kastelen bewaakt door Boom Boom, luchtschiplevels waar de Koopalings worden bevochten, en Bowser’s bolwerk. Het verslaan van een Koopaling brengt de gestolen toverstok terug en herstelt een koning tot normaal. In de tweespelermodus wisselen spelers de besturing af tussen Mario en Luigi op de wereldkaart, met de mogelijkheid om te strijden in bonusspellen geïnspireerd op de originele Mario Bros. arcadetitel.
Elke wereld in de Paddenstoelenwereld heeft zijn eigen thema, zoals graslanden, woestijnen, waterlevels, vijanden van reuzen, ijzige landschappen en zelfs lucht- en pijpomgevingen. Deze settings veranderen niet alleen het uiterlijk van de levels, maar introduceren ook unieke gevaren en levelontwerpen, wat zorgt voor variatie in de acht hoofdwerelden. Het spel bevat ook talrijke geheimen en verborgen paden, wat verkenning en experimenteren aanmoedigt.



